跟着测序时期的发展及粗鄙应用，越来越多的新发、凄惨变异被检出。然而对于临床道理道理未明(variants of uncertain signifcance, VUS)、新发错义变异的阐述和分类仍然是临床会诊的挑战。

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著述作家来自英国的皇家德文大学(Royal Devon University)保健NHS基金会信赖和埃克塞特大学医学院(University of Exeter School of Medicine)。商酌者经过预备机卵白质结构展望分析，将64个VUS进行再行分类。在再行评估后，将47个再行分类为致病性（P）或可能致病性（LP）。将卵白质结构信息纳入会诊奉行，并建议一个通用责任经由，联系遵守发表于《Genome Medicine》杂志。

作家发现很多错义变异(预备机展望后)会影响卵白质与配体的讨好或严重镌汰卵白质的踏实性，从而导致卵白质功能齐全丧失(complete loss-of-function, LOF)。有些错义变异则通过功能赢得机制(gain-of-function, GOF)影响卵白结构域的关节区域。

作家觉得预备机模拟卵白空间结构的展望凭据不错径直用于现存ACMG/ACGS指南中的PM1凭据品级，这有助于细则错义变异的展望致病效应与临床表型及已知致病机制之间的一致性。

PM1：Located in a mutational hot spot and/or critical and well-established functional domain (e.g., active site of an enzyme) without benign variation

PM1：位于热门突变区域, 和/或位于已知无良性变异的关节功能域(如酶的活性位点).

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作家纳入2016年至2020年转诊至埃克塞特基因组学履行室的患者中的变异，并进行卵白质结构展望分析。

具体的责任经由，如下：当先通过UniProtKB数据库(Universal Protein Knowledgebase (UniProtKB)查询联系卵白结构数据的可用性，要是莫得同源或展望模子，将卵白序列提交至卵白质建模管事器(SWISS-MODEL、Phyre2和 I-TASSER），生成野生型/突变型卵白结构，分析相比突变对卵白结构的影响。通过多模板建模生成的模子，独一当展望的置信度≥90%，才气用于进一步展望分析。使用PyMol软件商酌突变氨基酸对卵白空间结构的影响；使用FoldX软件对突变型卵白空间结构的热力学踏实性进行定量展望。

放胆：64个VUS，有47个在展望分析后，被再行分类为致病性或可能致病性变异。根据专科判断，这47个变异的展望结构数据可当作PM1凭据(13个为中等凭据，34个为相沿性凭据)，17个仍被分类为VUS。

从三个方面展望突变对卵白质的影响

分析跨物种的卵白质序列保守性(analysis of conservation in homologous proteins across species)；

模拟突变对卵白质质理化性质的影响(modelling the impact of mutation on  the physicochemical properties of the protein)；

卵白质热力学预备机展望(in silico thermodynamic predictions)：用于可能存在LOF机制的错义变异，对此识别具有高特异性。

当今，在东说念主类卵白质组中，仅17%卵白是通过履行判辨其结构；但通过预备机建模对比，不错用于结构分析的卵白比例增加到约50%。可用的卵白质数据库，如下：

AlphaFold 卵白结构库

七月末，DeepMind 发布 AlphaFold 卵白结构库(the AlphaFold Protein Structure Database, AFDB)，公布了独特2亿个卵白质的展望结构(包括了东说念主类卵白质组内的通盘20000个卵白质结构，还有大肠杆菌、果蝇、小鼠、斑马鱼、疟原虫、肺结核菌等)，险些囊括了整个东说念主类已知的卵白质序列(98.5%)。在2.14 亿条序列的展望结构中，35% 是高度准确的。

AFDB使用AF2机器学习法(AlphaFold-2 machine-learning method)，用pLDDT分数(a predicted Local Distance Diference Test score, pLDDT) 对展望的卵白结构进行自我评估，高于90分(满分100)属于高度确实。需要老成，pLDDT 打分极高，也依旧存在展望的结构与内容判辨的结构具有较大各异的可能。但对于大部分无履行判辨的结构，若展望的结构赢得高的pLDDT分数，也可被觉得高度确实。当今这部分高度确实的结构约莫有7500万个。此外，还有45%的结构，约9600万个，足以使用(pLDDT为70 ~ 90)。

3D-Beacons 是一项新器具，一个新组织。2022.8.3，英、瑞士、德、意、匈、荷、好意思、韩八国粹术机构结伙推出 3D-Beacons，整合包含 AFDB 在内的多个卵白质结构数据库，用长入边幅，检索履行结构、展望结构、动态结构系综等。

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PDBe：PDB欧洲，履行结构， PDB（卵白数据银行）约莫有19万个履行判辨结构，每年新增约1万个新结构。AlphaFold DB：重新展望AlphaFill：基于模板展望SWISS-MODEL Repository：瑞士模子库，基于模板展望ModelArchive：重新展望 / 基于模板展望SASBDB：Small-Angle Scattering Biological Data Bank，小角度衍射生物数据库PED：Protein Ensemble Database，卵白质系综数据库例如子

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商酌错义突变对卵白质结构的影响

升级致病性凭据的品级

制作“漂亮的”卵白质空间结构图

充实SCI写稿内容

增加审稿东说念主的有趣

晋升著述的可读性

提高SCI接收率

笔者从内容责任中例如

如下

卵白质保守性分析conservation 

从氨基酸序列角度分析：

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图1：黑框处示意DNA错义突变形成氨基酸变异方位的位置，通过跨多物种序列比对换取的位置，可见哺乳动物中，此处偏执临近氨基酸序列高度保守。这个图直不雅。

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字母的相对大小示意它们在序列中的频率。每个字母的高度与出现频率成正比，常以bits为单元。每个位置的字母按照保守性从大到小枚举，最从上端的字母，其保守性最高。

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同理，通过图2，分析变异位点处偏执临近氨基酸的保守性。这个图形象。

从卵白质空间结构角度分析：

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如图3：哄骗PyMol软件分析卵白保守序列的不同染色区域(永诀不同的保守性)。此图需要知说念氨基酸变异位点处于卵白质的什么结构域，该结构域具有什么功能。如图蓝色箭头所指为某变异位点。黄色圈圈内，可见变异位点偏执临近均为红色(红色为高度保守)，说明其参与形成的空间结构高度保守，该处结构具有某些紧迫功能，比如这个空间结构为卵白质讨好口袋(protein binding pockets)，口袋是指卵白质名义或里面具有符合与配体讨好的空腔，口袋周围的氨基酸残基决定了它的阵势，位置，逝世特点以及功能。口袋是卵白质发生特异性互相作用的紧迫结构。卵白质结构的柔性(flexibility)与指令(mobility)允许讨好口袋的翻开、关闭和适应，从而疗养配体的讨好过程和阐发特定的卵白质功能。是以此图就不错阐述为：错义变异形成氨基酸变异，更正空间结构的保守性，然后碎裂XX功能，然后巴拉巴拉等等。。。著述中有这么的图是不是很棒？增加说明力。

卵白质热力学踏实性分析thermodynamic stability

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如图4：已知p.G195D位点，已通过体外磨真金不怕火说明了其变异的无益性，p.G195D增加了变异位点处的泛素化、增加了该卵白与F-actin讨好才略，从而增加对肾足突细胞的无益性，体现了GOF的致病机制，而哄骗DynaMut对卵白质热力学踏实性分析，踏实性镌汰，且发现变异位点科罚子互相之间作使劲增加(对比突变型和野生型，发现虚线增加，虚线代表分子间作使劲)，不错臆度其与GOF计划，与泛素化增加和讨好才略增加计划。而新发现的变异位点p.A165V与p.G195D处于团结个结构域。因此不错臆度，它们有雷同的机制。相同对p.A165V进行卵白质热力学踏实性分析，踏实性镌汰，且发现变异位点科罚子互相之间作使劲增加。因此可觉得，新发现的变异位点p.A165V虽未作念体外考据性磨真金不怕火，但其展望放胆与已知p.G195D位点的预备机展望放胆一致，可推断新发位点的无益性。

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图5：LOF是常见的致病机制，热力学不踏实是一种通用机制，错义变异会导致卵白质空间结构域的特殊折叠和/或降解，如图使用FoldX对变异位点p.Pro163Arg进行评估。哄骗PyMol软件构建卵白质空间结构。Pro163 位于一个环中，形成卵白质细胞外区，不衔接钙讨好区的一部分，侧链被非极性氨基酸掩埋并包围。Arg取代Pro可能会导致与相邻侧链的空间冲破，同期将Arg的带电极性侧链置于疏水卵白中枢中。FoldX展望变异为极其不踏实的变化。卵白质理化性质分析physicochemical properties

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图6：错义变异引起LOF的另一种潜在机制是碎裂与配体讨好。图示GNAO1基因的错义变异位点p.Thr327Lys。因为现存的东说念主类GNAO1卵白履行结构模子未能提供整个的核苷酸讨好域或讨好配体，是以给与小鼠的Gnao1模子PDB 3c7k(与东说念主类同源性 97.7%)和东说念主类GNAi1模子PDB 6crk(与东说念主类GNAO1同源性为73.8%)；图内模子用的是6crk模子，3c7k模子未清楚，但放胆与6crk模子一致。不错与核苷酸讨好的G盒残基结构示意为蓝色；Thr327的碳原子呈橙色；未突变时，放胆清楚(图6A)：鸟嘌呤核苷酸(GDP)可径直与Thr327讨好，并互相作用。当Thr327突变成Lys，放胆清楚(图6B)：长型结构的Lys(赖氨酸)侧链阻塞配体讨好口袋，从而防碍GDP讨好(配体在展望结构中缺失)。

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与LOF不同，导致GOF的变异频繁难以阐述，因为对结构的影响可能愈增多变。也有凭据清楚，对于非LOF的错义变异的无益性展望来说，其弘扬频繁较差，因此对其进行卵白质结构模子展望分析利害常故意的。一些卵白存在活性和非活性两种构象，非活性阵势构象的不踏实，活性阵势的踏实化，王人会导致GOF的发生。图7：MAP2K1基因变异位点p.Leu50Pro。MAPK1基因编码MAP/ERK激酶1(MEK1)，卵白质N端的负疗养区(NRR)，位于催化结构域除外，守护激酶处于非活性状况。Leu50位于NRR螺旋的内名义，与激酶结构域中的Asn122和Pro124战争(图7B)。FoldX分析清楚ΔΔG值为4.4 kcal/mol，错义变异导致卵白质结构严重不踏实。NRR区域的结构不踏实，使得MEK1激酶处于捏续激活状况，这与致病性变异导致卵白质局部空间不踏实引起的GOF机制一致。

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GOF不错介导活性卵白质的产量晋升或减少卵白质降解。图8：WNK1 基因错义变异p.Asp635Asn，该变异位点位于卵白质序列的无序区域(regions of disordered)，无履行或高质地的展望模子。而事实上，无序区域(intrinsically disordered regions)也并非毫无作用，它们不错形成卵白质-卵白质之间弱互相作用(weak interactions)，形成凝合物或无膜的轻细胞器，参与大分子分拨和其他细胞过程。很多无序的区域还包含短线性基序(short linear motifs, SLiM)，可能当作卵白质-卵白质互相作用或翻译后修饰的靶点。作家哄骗真核线性基序资源(Eukaryotic Linear Motif resource, ELM)和 ScanSite 4.0扫描了野生型和突变型WNK1序列中潜在的功能位点。放胆清楚野生型WNK1序列中(601~700)存在一个与Kelch讨好的degron基序，而p.Asp635Asn中这个基序隐藏了(图8)。Degron是一种酸性基序，可介导与KLHL3的互相作用，形成KLHL3-Cullin复合物，扶持卵白酶体降解含有degron的卵白。因此，本案例中的错义变异，引起degron基序隐藏，卵白酶体无法完成降解作用，使得卵白质诡秘降解，从而导致靶卵白的积贮和活性提高，这是GOF致病机制的一种阐述。

局限性

某些错义变异可能从预备机展望角度分析，对卵白质折叠或空间结构的影响是良性，但在体内，该变异可能对卵白质折叠或空间结构产生紧迫影响。

处于卵白名义的氨基酸变异可能会潜在性地影响卵白质之间的互相作用。预备机展望对此可能会有些贫瘠。当今对于卵白质结构的配体和大分子互相作用的位点等这类信息，不错从已知的数据库(如PDBe-KB、VarMap、VarSite)中赢得。处于卵白名义的氨基酸变异可能导致疏水性区域(hydrophobic patches)的产生，这会使得卵白质结伙，例如HBB基因的错义突变p.Glu6Val，会导致镰状细胞贫血。天然依然成就出很多生物信息学器具来匡助展望卵白质结伙(protein aggregation)，但在错义变异的致病性阐述中，这类生物信息学器具很少使用。

由于这些原因，卵白质空间结构预备机展望为良性的错义变异，并不成扼杀该变异内容上可能是无益的。有商酌报说念觉得，在预备机结构性展望中组合使用序列保守性分析和热力学踏实性分析，不错很好地将致病性和良性的变异充分永诀开。多阵势展望组合和空洞性地使用卵白质结构数据，将有助于变异分类。

参考文件：

Caswell RC, Gunning AC, Owens MM, et al. Assessing the clinical utility of protein structural analysis in genomic variant classification: experiences from a diagnostic laboratory. Genome Med, 2022, 22;14(1):77. doi: 10.1186/s13073-022-01082-2.

更多内容用什么要领展望错义突变是否影响卵白质的踏实性？手把手教 | 如何用Jalview作念卵白质序列比对及保守性分析如有上述雷同的作图需要，可私信笔者天然需要小数点用度啦每一张图每一个错义变异位点50元东说念主民币应该不贵吧感谢相沿PyMol软件作图，如下

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